ВИЗУАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИНТЕРНАЛИЗАЦИ КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТРЫХ И МАГНИЙ-ФОСФАТНЫХ БИОНОВ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ МЕТОДАМИ СКАНИРУЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ И КОНФОКАЛЬНОЙ МИКРОСКОПИИ

Цель исследования – оценить, происходит ли интернализация кальций-фосфатных и магний-фосфатных бионов эндотелиальными клетками.

материал и методы. Искусственно синтезированные путем перенасыщения культуральной среды соответствующими солями магний-фосфатные бионы (МФБ), а также сферические и игольчатые кальций-фосфатные бионы (СКФБ и ИКФБ) были добавлены к конфлюэнтным культурам первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека на 4 ч. Для визуализации интернализации бионов эндотелиальные клетки изучали методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) в обратнорассеянных электронах и конфокальной микроскопии. Для СЭМ изучаемые клетки были фиксированы в 10%-м забуференном формалине, постфиксированы/окрашены 2%-м тетраоксидом осмия, дегидратированы воздействием спиртов возрастающей концентрации, окрашены 2%-м уранилацетатом, пропитаны смесью ацетона и эпоксидной смолы, заключены в чистую эпоксидную смолу для создания полимеризованных эпоксидных блоков с их последующей шлифовкой и полировкой. Эпоксидные блоки контрастировали цитратом свинца путем нанесения на поверхность шлифованного образца с последующим напылением блоков углеродом и собственно СЭМ. Для анализа интернализации бионов клетками методом конфокальной микроскопии к синтезированным бионам был добавлен меченный флуоресцеинизотиоцианатом альбумин (МФБ) или кальцеин (КФБ) с последующим добавлением к клеточным культурам лизосомального красителя LysoTracker Red и ядерного красителя Hoechst 33342.

Результаты. Все изученные виды бионов интернализировались эндотелиальными клетками в течение 4 ч. При СЭМ отчетливо визуализировались множественные черные электронноплотные минеральные включения в цитоплазме клеток, отсутствующие как внутри контрольных клеток, так и в межклеточном пространстве. Конфокальная микроскопия позволила детектировать интернализированные клетками МФБ и КФБ, которые находились в цитоплазме клеток или были ко-локализованы с лизосомами.

 Заключение. При помощи СЭМ в обратнорассеянных электронах удалось визуализировать МФБ и КФБ, интернализированные эндотелиальными клетками после четырехчасовой экспозиции. Посредством конфокальной микроскопии выявлено, что состоящие из малорастворимого гидроксиапатита КФБ после интернализации оказываются в лизосомах. МФБ также оказываются в лизосомах, однако детектируются хуже вследствие большей растворимости магний фосфат гидрата. Следовательно, МФБ являются подходящей группой сравнения для оценки специфичности токсического действия КФБ на эндотелий, поскольку данные типы бионов обладают не только близкими физико-химическими свойствами, но и идентично интернализируются эндотелиальными клетками.

1. Gooding H., Johnson H.M. The unchartered frontier: preventive cardiology between the ages of 15 and 35 years // Curr. Cardiovasc. Risk Rep. 2016. Vol. 10, N 9. pii 29.

2. Larsson T.E., Olauson H., Hagström E., Ingelsson E., Arnlov J., Lind L., Sundstrom J. Conjoint effects of serum calcium and phosphate on risk of total, cardiovascular, and noncardiovascular mortality in the community // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2010. Vol. 30, N 2. P. 333–339.

3. Sun Z.L., Xie Q.Y., Guo G.L., Ma K., Huang Y.Y. Serum fetuin-A levels in patients with cardiovascular disease: a meta-analysis // Biomed. Res. Int. 2014. Vol. 2014. P. 691540.

4. Sonou T., Ohya M., Yashiro M., Masumoto A., Nakashima Y., Ito T., Mima T., Negi S., Kimura- Suda H., Shigematsu T. Mineral composition of phosphate-induced calcification in a rat aortic tissue culture model // J. Atheroscler. Thromb. 2015. Vol. 22, N 11. P. 1197–206.

5. Heiss A., Pipich V., Jahnen-Dechent W., Schwahn D. Fetuin-A is a mineral carrier protein: small angle neutron scattering provides new insight on Fetuin-A controlled calcification inhibition // Biophys. J. 2010. Vol. 99, N 12. P. 3986–3995.

6. Köppert S., Büscher A., Babler A., Ghallab A., Buhl E.M., Latz E., Hengstler J.G., Smith E.R., Jahnen-Dechent W. Cellular clearance and biological activity of calciprotein particles depend on their maturation state and crystallinity // Front. Immunol. 2018. Vol. 9. ID 1991.

7. Wu C.Y., Young L., Young D., Martel J., Young J.D. Bions: a family of biomimetic mineralo-organic complexes derived from biological fluids // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 9. ID e75501.

8. Kutikhin A.G., Velikanova E.A., Mukhamadiyarov R.A., Glushkova T.V., Borisov V.V., Matveeva V.G., Antonova L.V., Filip’ev D.E., Golovkin A.S., Shishkova D.K., Burago A.Y., Frolov A.V., Dolgov V.Y., Efimova O.S., Popova A.N., Malysheva V.Yu., Vladimirov A.A., Sozinov S.A., Ismagilov Z.R., Russakov D.M., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V., Gutakovsky A.K., Zhivodkov Yu.A., Demidov E.A., Peltek S.E., Dolganyuk V.F., Babich O.O., Grigoriev E.V., Brusina E.B., Barbarash O.L., Yuzhalin A.E. Apoptosis-mediated endothelial toxicity but not direct calcification or functional changes in anticalcification proteins defines pathogenic effects of calcium phosphate bions // Sci. Rep. 2016. Vol. 6. ID 27255.

9. Young J.D., Martel J., Young D., Young A., Hung C.M., Young L., Chao Y.J., Young J., Wu C.Y. Characterization of granulations of calcium and apatite in serum as pleomorphic mineralo-protein complexes and as precursors of putative nanobacteria // PLoS One. 2009. Vol. 4, N 5. ID e5421.

10. Шишкова д.К., глушкова Т.в., Ефимова О.С., попова А.н., малышева в.ю., Колмыков Р.п., исмагилов З.Р., гутаковский А.К., живодков ю.А., Кожухов А.С., долганюк в.ф., барбараш О.Л., Кутихин А.г. Сравнение морфологических и химических свойств сферических и игольчатых кальций-фосфатных бионов // Комплекс. пробл. серд.сосуд. заболеваний. 2019. Т. 8, ¹ 1. С. 59–69.

11. Шишкова д.К., великанова Е.А., матвеева в.г., Кудрявцева ю.А., Кутихин А.г. Специфичная токсичность кальций-фосфатных бионов для культур венозных и артериальных эндотелиальных клеток человека // Патол. физиология и эксперим. терапия. 2019. Т. 63, ¹ 1. С. 53–61.

12. Шишкова д.К., Синицкий м.ю., великанова Е.А., Кутихин А.г. Кальций-фосфатные бионы индуцируют секрецию провоспалительных цитокинов интерлейкина-6 и интерлейкина-8 артериальными эндотелиальными клетками in vitro // Цитокины и воспаление. 2018. Т. 17, ¹ 1-4. С. 80–85.

13. Кутихин А.г., великанова Е.А., Шишкова д.К. Форма кальций-фосфатных бионов определяет выраженность вызываемого ими проатеросклеротического сдвига профиля секретируемых эндотелиальными клетками цитокинов // Евраз. кардиол. журн. 2017. ¹ 4. С. 4–9.

14. Шишкова д.К., великанова Е.А., Кривкина Е.О., миронов А.в., Кудрявцева ю.А., Кутихин А.г. Кальций-фосфатные бионы специфично индуцируют гипертрофию поврежденной интимы у крыс // Рос. кардиол. журн. 2018. Т. 23, ¹ 9. С. 33–38.

15. Шишкова д.К., великанова Е.А., Кривкина Е.О., миронов А.в., Кудрявцева ю.А., Кутихин А.г. Токсическое действие кальций-фосфатных бионов на адвентицию брюшной аорты крыс // Атеросклероз и дислипидемии. 2018. Т. 3, ¹ 32. С. 37–43.

16. Queiroz K.C., Bijlsma M.F., Tio R.A., Zeebregts C.J., Dunaeva M., Ferreira C.V., Fuhler G.M., Kuipers E.J., Alves M.M., Rezaee F., Spek C.A., Peppelenbosch M.P. Dichotomy in Hedgehog signaling between human healthy vessel and atherosclerotic plaques // Mol. Med. 2012. Vol. 18. P. 1122–1127.

17. Aghagolzadeh P., Bachtler M., Bijarnia R., Jackson C., Smith E.R., Odermatt A., Radpour R., Pasch A. Calcification of vascular smooth muscle cells is induced by secondary calciprotein particles and enhanced by tumor necrosis factor-α // Atherosclerosis. 2016. Vol. 251. P. 404–414.

18. Smith E.R., Hanssen E., McMahon L.P., Holt S.G. Fetuin-A-containing calciprotein particles reduce mineral stress in the macrophage // PLoS One. 2013. Vol. 8, N 4. ID e60904.

19. Шишкова д.К., глушкова Т.в., Ефимова О.С., попова А.н., малышева в.ю., Колмыков Р.п., исмагилов З.Р., гутаковский А.К., живодков ю.А., Кожухов А.С., Севостьянов О.г., долганюк в.ф., Кутихин А.г. Морфологическая и химическая характеризация магний-фосфатных и кальций-фосфатных бионов // Фундамент. и клин. медицина. 2019. Т. 4, ¹ 2. С. 6–16.

20. Шишкова д.К., великанова Е.А., Кутихин А.г. Специфичная индукция кальций-фосфатными бионами провоспалительного сдвига профиля цитокинов, секретируемых эндотелиальными клетками // Кардиол. вестн. 2018. Т. 13, ¹ 1. С. 51–58.

21. Liu Z., Xiao Y., Chen W., Wang B., Wang G., Xub X., Tang R. Calcium phosphate nanoparticles primarily induce cell necrosis through lysosomal rupture: the origination of material cytotoxicity // J. Mater. Chem. B. 2014. Vol. 2. P. 3480–3489.

22. Shyong Y.J., Wang M.H., Kuo L.W., Su C.F., Kuo W.T., Chang K.C., Lin F.H. Mesoporous hydroxyapatite as a carrier of olanzapine for long-acting antidepression treatment in rats with induced depression // J. Control Release. 2017. Vol. 255. P. 62–72.

23. Zhang C.Y., Sun X.Y., Ouyang J.M., Gui B.S. Diethyl citrate and sodium citrate reduce the cytotoxic effects of nanosized hydroxyapatite crystals on mouse vascular smooth muscle cells // Int. J. Nanomedicine. 2017. Vol. 12. P. 8511–8525.

24. Yuan Y., Liu C., Qian J., Wang J., Zhang Y. Sizemediated cytotoxicity and apoptosis of hydroxyapatite nanoparticles in human hepatoma HepG2 cells // Biomaterials. 2010. Vol. 31, N 4. P. 730–740.

25. мухамадияров Р.А., Кутихин А.г. Исследование нормальной и патологической микроскопической анатомии кровеносных сосудов при помощи сканирующей электронной микроскопии в обратнорассеянных электронах // Фундамент. и клин. медицина. 2019. Т. 4, ¹ 1. С. 6–15.