Мухамадияров Ринат Авхадиевич – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины
650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6
650002, Kemerovo, Sosnovy blvd., 6
Кутихин Антон Геннадьевич – кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины
650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6
650002, Kemerovo, Sosnovy blvd., 6
Цель исследования – изучить типы кальцификатов в составе атеросклеротических бляшек сонных артерий, используя оригинальный метод окрашивания тканей, их заключения в эпоксидную смолу и сканирующую электронную микроскопию в обратнорассеянных электронах.
Материал и методы. Атеросклеротические бляшки, извлеченные в процессе каротидной эндартерэктомии, фиксировались 10%-м забуференным формалином в течение 24 часов, окрашивались 2%-м тетраоксидом осмия в течение 60 часов и спиртовым раствором уранилацетата в течение 5 часов с последующим заключением в эпоксидную смолу, шлифовкой, полировкой, контрастированием цитратом свинца по Рейнольдсу в течение 7 минут, напылением углеродом и сканирующей электронной микроскопией в обратнорассеянных электронах. На цифровых микрофотографиях идентифицировали локализацию кальцификатов, их структурные особенности, клеточное и неклеточное окружение.
Результаты. Наиболее характерным типом кальцификации в атеросклеротических бляшках были крупные компактные гомогенные кальцификаты; также встречались обширные продольные гетерогенные очаги минерализации, предположительно образующиеся преимущественно в результате направленной дезинтеграции коллагеновых и эластических волокон вследствие действия матриксных протеаз. Возле обоих типов макрокальцификатов с неровными краями обнаруживались многочисленные микрокальцификаты, количество которых постепенно уменьшалось по мере удаления от макрокальцификата. При этом даже в относительно гомогенных компактных кальцификатах наблюдалась некоторая неоднородность электронной плотности, что в сочетании с близко расположенными группами кальцификатов различной степени зрелости с зарождающимися кальцификатами или постепенно объединяющимися микрокальцификатами свидетельствовало об активно идущих процессах химической трансформации фосфата кальция и оссификации. Компактные, постепенно подвергающиеся оссификации кальцификаты с ровными и гладкими краями в завершающей стадии оссификации часто имели плотную соединительнотканную оболочку. Также микроокружение кальцификатов, как правило, содержало новообразованные кровеносные сосуды с разной площадью и толщиной стенок.
Заключение. Полученные данные достаточно наглядно демонстрируют многообразие форм кальцификации и процесс оссификации, что позволяет провести патогенетические параллели с пороками нативных клапанов сердца и дисфункций их биопротезов. Примененный методический подход в комплексе с другими методами (в частности, дезагрегацией атеросклеротических бляшек с дальнейшей проточной цитометрией и полнотранскриптомным секвенированием одиночных клеток) может внести свой вклад в понимание кальцификации при атеросклерозе и поможет идентифицировать терапевтические мишени с целью ее предотвращения и ингибирования.
Aim of the study was to investigate the atherosclerotic calcification employing our original technique of tissue staining, embedding, and backscattered scanning electron microscopy.
Materials and methods. Atherosclerotic plaques excised during the carotid endarterectomy have been fixed in 10 % neutral phosphate buffered saline formalin for 24 hours, stained in 2 % osmium tetroxide for 60 hours and in alcoholic uranyl acetate for 5 hours with the subsequent epoxy resin embedding, grinding, polishing, lead citrate counterstaining for 7 minutes, sputter coating with carbon and backscattered scanning electron microscopy. We then analysed localisation, structure, and microenvironment of the calcium deposits.
Results. Within the atherosclerotic plaques, we identified 3 distinct calcification morphologies: compact homogenous macrocalcifications, sheet-like heterogeneous macrocalcifications along the destructed collagen and elastin fibers, and microcalcifications around large calcium deposits with the sharp margins. However, even relatively homogenous compact macrocalcifications had uneven distribution of electron density. In conjunction with groups of mineral deposits of distinct calcium phosphate phases including nascent calcified loci, this testified to ongoing calcium phosphate maturation while multiple microcalcifications merging into the single macrocalcification indicated ossification. Compact ossifying macrocalcifications with smooth margins frequently had a dense connective tissue capsule. The microenvironment of calcium deposits was often characterised by leaky neovessels.
Conclusion. Diversity of calcification morphologies and ossification in atherosclerotic plaques is similar to those observed in calcific aortic valve disease and bioprosthetic heart valve failure. Combined with atherosclerotic plaque disaggregation followed by flow cytometry and singlecell RNA sequencing, our technique may improve our understanding of atherosclerotic calcification and lead to the identification of appropriate therapeutic targets to prevent or retard this process.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.