Цель исследования – оценить, происходит ли интернализация кальций-фосфатных и магний-фосфатных бионов эндотелиальными клетками.
материал и методы. Искусственно синтезированные путем перенасыщения культуральной среды соответствующими солями магний-фосфатные бионы (МФБ), а также сферические и игольчатые кальций-фосфатные бионы (СКФБ и ИКФБ) были добавлены к конфлюэнтным культурам первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека на 4 ч. Для визуализации интернализации бионов эндотелиальные клетки изучали методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) в обратнорассеянных электронах и конфокальной микроскопии. Для СЭМ изучаемые клетки были фиксированы в 10%-м забуференном формалине, постфиксированы/окрашены 2%-м тетраоксидом осмия, дегидратированы воздействием спиртов возрастающей концентрации, окрашены 2%-м уранилацетатом, пропитаны смесью ацетона и эпоксидной смолы, заключены в чистую эпоксидную смолу для создания полимеризованных эпоксидных блоков с их последующей шлифовкой и полировкой. Эпоксидные блоки контрастировали цитратом свинца путем нанесения на поверхность шлифованного образца с последующим напылением блоков углеродом и собственно СЭМ. Для анализа интернализации бионов клетками методом конфокальной микроскопии к синтезированным бионам был добавлен меченный флуоресцеинизотиоцианатом альбумин (МФБ) или кальцеин (КФБ) с последующим добавлением к клеточным культурам лизосомального красителя LysoTracker Red и ядерного красителя Hoechst 33342.
Результаты. Все изученные виды бионов интернализировались эндотелиальными клетками в течение 4 ч. При СЭМ отчетливо визуализировались множественные черные электронноплотные минеральные включения в цитоплазме клеток, отсутствующие как внутри контрольных клеток, так и в межклеточном пространстве. Конфокальная микроскопия позволила детектировать интернализированные клетками МФБ и КФБ, которые находились в цитоплазме клеток или были ко-локализованы с лизосомами.
Заключение. При помощи СЭМ в обратнорассеянных электронах удалось визуализировать МФБ и КФБ, интернализированные эндотелиальными клетками после четырехчасовой экспозиции. Посредством конфокальной микроскопии выявлено, что состоящие из малорастворимого гидроксиапатита КФБ после интернализации оказываются в лизосомах. МФБ также оказываются в лизосомах, однако детектируются хуже вследствие большей растворимости магний фосфат гидрата. Следовательно, МФБ являются подходящей группой сравнения для оценки специфичности токсического действия КФБ на эндотелий, поскольку данные типы бионов обладают не только близкими физико-химическими свойствами, но и идентично интернализируются эндотелиальными клетками.
Aim of the study was to investigate whether endothelial cells internalise magnesium phosphate and calcium phosphate bions.
Material and methods. Magnesium phosphate and calcium phosphate bions synthesised through supersaturation of the culture medium with the respective salts were further added to the confluent cultures of primary human coronary artery endothelial cells for 4 h. Internalisation was evaluated by backscattered scanning electron microscopy (BSEM) and confocal microscopy. For BSEM, cells were fixed in 10% neutral phosphate buffered formalin, postfixed/stained by 2 % osmium tetroxide, dehydrated in a graded ethanol series, stained by 2% uranyl acetate, impregnated into acetone:epoxy resin (1:1) and into the fresh epoxy resin with its subsequent polymerisation, grinding, and polishing. Samples were then counterstained by lead citrate, sputter coated with carbon, and visualised utilising BSEM. Confocal microscopy was conducted after exposure of endothelial cells to FITC-labeled magnesium phosphate bions or calcein-labeled calcium phosphate bions with the following staining by a pH sensor LysoTracker Red and nuclear stain Hoechst 33342.
Results. All types of bions were internalised by endothelial cells within 4 h. BSEM after long-term postfixation/ staining by osmium tetroxide and uranyl acetate, embedding into epoxy resin and counterstaining by lead citrate visualised multiple black electron-dense mineral inclusions which were not detected both within the control cells and in the intercellular space. Confocal microscopy also detected internalised MPB and CPB in cytosol and lysosomes.
Conclusion. BSEM visualised MPB and CPB internalised by endothelial cells after 4 h exposure while confocal microscopy detected their colocalisation with lysosomes. MPB is an appropriate comparison group to study the specificity of CPB-related pathogenic effects as both of these bion types have close physico-chemical properties and are similarly internalised.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.